中国科学院西北高原生物研究所闫淑萍，王硕，陈涛，申诚，杨丽，李玉林和青海金麦杞生物科技有限公司赵景阳，丁永渊，孔令繁为研究黑果枸杞花青素提取物(anthocyanin extract of Lycium ruthenicum Murr., AEL)对急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis, AGA)大鼠的作用,将60 只雄性SD 大鼠,随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、AEL 高剂量组(238.0 mg/kg)和AEL 低剂量组(59.5 mg/kg),每组12只,分为2 批,每批6 只。第一批动物灌胃2 周,第二批动物灌胃4 周后,采用50 mg/mL 微晶型尿酸钠(microcrystalline sodium urate, MSU) 0.2 mL 注射到大鼠右踝关节诱导大鼠急性痛风性关节炎模型,评价AEL 对AGA 大鼠踝关节肿胀和跛行步态的改善效果。所有动物继续灌胃至5 周,采用质量分数2.5%的氧嗪酸钾饲料喂食诱导高尿酸血症模型,测定造模2 h、3 h 后大鼠的血清尿酸水平。研究发现,与模型对照组比较,灌胃2 周,AEL 高剂量能明显缓解大鼠造模6 h 后踝关节肿胀,改善跛行步态；灌胃4 周,AEL 高、低剂量均能明显缓解大鼠造模后6 h、24 h 踝关节肿胀和改善造模6 h 后跛行步态,AEL 高剂量还能明显改善造模24 h 后跛行步态；灌胃5 周后,AEL 高、低剂量均能明显抑制氧嗪酸钾导致的大鼠血清尿酸升高。结果表明,AEL 能从抗炎和降尿酸两个方面对大鼠急性痛风性关节炎表现出明显改善作用。

由于经济发展带来的生活方式及饮食结构的变化,痛风性关节炎发病率逐年增长且呈现年轻化趋势,全球痛风性关节炎患病率约达10% ^[1-2]。痛风性关节炎分为急性期、间歇期和慢性痛风石期,其中急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis, AGA)是由于机体嘌呤代谢紊乱、血清尿酸水平升高,尿酸盐沉积在关节囊、滑囊、软骨和其他组织中,从而刺激关节引起的关节滑膜及周围组织的病损或炎症反应的急性发作^[3-4],早期发病隐匿,一旦发作难以根治且易反复,临床主要表现为关节红肿灼热、剧烈疼痛、行动不便,常伴随着肾脏疾病和关节的不可逆损伤,严重影响患者的生活质量^[5]。目前,治疗急性痛风性关节炎以消炎镇痛和降低血清尿酸为主^[6],临床常用秋水仙碱联合非布司他、溴苯马龙以及非甾体类药物等西药治疗,虽然效果明显,但停药后易复发,长期服用还会出现胃肠道反应及肝肾功能损伤^[7]。中医药治疗痛风历史悠久,具有多途径、多层次的优势,且安全性更高^[8-9],因此,在天然产物中寻找具有防治痛风和降尿酸的功能性成分以及以此为基础开发相关功能性食品成为发展大健康产业新的热点。

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)是茄科枸杞属多棘刺落叶灌木,其果实富含花青素、多糖等活性成分,是目前发现的花青素含量最高的植物^[10]。黑果枸杞花青素属于类黄酮物质,具有抗氧化、抗疲劳、调节血脂等多种生物活性^[11 -13]。近年来,花青素的抗炎活性受到广泛关注,并且有研究报道紫甘薯中的花青素具有降尿酸作用^[14 -15],但关于黑果枸杞花青素抗炎和降尿酸的研究鲜有报道。微晶型尿酸钠(microcrystalline sodium urate, MSU)诱发的急性关节炎,因表现出早期急性发作,迅速出现高峰和随后缓解的特点,符合人体急性痛风性关节炎的临床症状,且操作简单、成功率高而成为国际上常用的AGA 模型,被广泛用于筛选具有改善急性痛风性关节炎作用的天然产物；氧嗪酸钾是尿酸酶抑制剂,能在短时间内快速升高血清尿酸。因此,本研究采用MSU 诱导大鼠急性痛风性关节炎模型和氧嗪酸钾饲料诱导大鼠高尿酸血症模型,分析黑果枸杞花青素提取物(anthocyanin extract of Lycium ruthenicum,AEL)对模型大鼠踝关节肿胀、跛行步态、血清尿酸水平等指标的影响,从抗炎和降尿酸方面评价AEL 对大鼠急性痛风性关节炎的作用,以期为黑果枸杞资源的多元化开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠60 只,雄性,实验动物使用许可证号:SYXK(津)2016-0009,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物饲养符合国家实验动物福利指南及实验动物伦理规范。饲养条件:标准屏障系统动物房,温度(22 ±2) ℃,湿度40% ～60%,12 h 光照昼夜交替。

1.2 实验原料与试剂

黑果枸杞,由青海金麦杞生物科技有限公司提供,中国科学院西北高原生物研究所藏药标准化与新药研发实验室鉴定为黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)的干燥果实；秋水仙碱片,西双版纳药业有限责任公司；生理盐水,河北天成药业股份有限公司；尿酸检测试剂盒(C012-2),南京建成生物工程研究所；微晶型尿酸钠和质量分数2.5%氧嗪酸钾饲料,天津药物研究院新药评价有限公司；LESINURAD,上海再启生物技术有限公司。

1.3 仪器与设备

Multiskan FC 型酶标仪,美国赛默飞世尔科技有限公司；PV-200 型足趾容积测量仪,成都泰盟科技有限公司；ECA522 型电子天平、ECC2201 型电子天平,南京伯尼塔科学仪器有限公司；CTXNW-110B 型循环超声提取机,北京宏祥隆生物技术开发有限公司；GQ105B 型管式离心机,上海浦东天本离心机械有限公司；GLZ-1B 型冷冻干燥机,上海浦东冷冻干燥设备有限公司；SJN-150-00 型双效浓缩器,浙江温兄机械阀业有限公司；BM-40 型纯水机,北京中盛茂源科技发展有限公司。

1.4 黑果枸杞花青素样品的制备

称取10 kg 黑果枸杞干果去梗、破碎,过60 目筛,置于超声提取机中,加150 L 去离子水超声提取30 min,超声功率500 W,提取完成后放出提取液,再加150 L 去离子水,重复上述提取过程。合并两次水提液约280 L,20000 r/min 离心5 min,收集上清液。上清液以100 L/h 流速泵入大孔树脂柱(树脂柱规格:100L,树脂型号:AB-8,树脂量:35 kg),用100 L 去离子水洗脱后,再用300 L 体积分数为50%的乙醇洗脱,收集洗脱组分,在45 ℃、 -0.07 MPa条件下用双效浓缩器减压浓缩得到浓缩液10 L,置于冷冻干燥机中冷冻干燥得到黑果枸杞花青素提取物595.2 g,经鉴定该组分花青素质量分数为30.1%。

1.5 动物分组与处理

选用健康SD 大鼠60 只,雄性,体重185 ～210 g,适应性饲养一周后随机分组。分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、AEL 高剂量组(238 mg/kg)和AEL 低剂量组(59.5 mg/kg),每组12 只,分两批(6 只/批)。按上述分组灌胃,其中正常对照组及模型对照组灌胃给予等量蒸馏水,阳性对照组在造模5 天前灌胃给予秋水仙碱(1 mg/kg),灌胃容积均为10 mL/kg,每天一次。第一批灌胃2周,第二批灌胃4 周。

1.6 急性痛风性关节炎大鼠踝关节肿胀度的检测

取1.5 节的第一批大鼠进行踝关节肿胀测定实验。参考文献方法^[16-17],正常对照组大鼠右踝关节背侧注射生理盐水0.2 mL(关节伸直45°进针),其余各组在右踝关节背侧注射50 mg/mL MSU 混悬液0.2 mL 造模。用足趾容积测量仪分别测定造模前和造模后6 h、24 h 大鼠右踝关节容积。

取1.5 节的第二批大鼠按照相同方法进行实验,测定造模前和造模后6、24、48 h 大鼠踝关节容积。

1.7 急性痛风性关节炎大鼠步态的检测

观察并记录1.6 节的各组大鼠造模前后的步态变化。第一批大鼠记录造模前和造模后6 h、24 h 步态,第二批大鼠记录造模前和造模后6、24、48 h 步态。参照文献分级标准^[17],0 级,正常行走,记为0分；1 级,轻微跛行,受试下肢略有弯曲,记为1 分；2级,中度跛行,受试下肢刚触及地面,记为2 分；3级,重度跛行,受试下肢离开地面,三足着地行走,记为3 分。统计各组大鼠得分。

1.8 大鼠血清尿酸浓度的检测

将造模后的两批大鼠按1.5 节方法持续灌胃至5周,阳性对照组改用LESINURAD(尿酸重吸收抑制剂,由FDA 在2015年批准与黄嘌呤氧化酶抑制剂联用,用于治疗与痛风相关的高尿酸血症^[18-19]),在测定前3 d连续灌胃,剂量为40 mg/kg。参考文献方法^[20-21],末次灌胃后,各组大鼠喂食质量分数2.5%氧嗪酸钾饲料,分别于2 h、3 h 尾静脉采血,3500 r/min 离心10 min 取血清,按照试剂盒方法测定大鼠血清尿酸水平。

1.9 数据处理

数据均以平均值±标准差(x ±s)表示,以SPSS 16.0 软件进行数据统计分析,采用t 检验及进行组间比较,有等级关系的采用等级序值法进行显著性检验。

2 结果分析

2.1 黑果枸杞花青素提取物对大鼠踝关节肿胀的影响

AEL 灌胃2 周后,对AGA 模型大鼠踝关节肿胀度的影响见表1。由表1 可知,与正常对照组比较,模型对照组踝关节容积明显增加(P＜0.01),表明模型建立成功。与模型对照组比较,秋水仙碱能够明显减轻造模后6、24 h 的踝关节肿胀(P＜0.01,P＜0.05)；AEL 高剂量能明显减轻造模6 h 后的踝关节肿胀(P＜0.05),对减轻造模24 h 后踝关节肿胀效果不明显；AEL 低剂量对造模后6 h、24 h 的踝关节肿胀无显著影响。

表1 黑果枸杞花青素提取物灌胃2 周对MSU 诱导的AGA 大鼠踝关节肿胀度的影响

ΔΔ 表示与正常对照组比较有极显著差异(P＜0.01)；*表示与模型对照组比较有显著差异(P＜0.05),**表示与模型对照组比较有极显著差异(P＜0.01)。

大鼠AGA 模型中,造模4 h 后大鼠踝关节开始肿胀,6 ～8 h 达到高峰,一般可维持至24 h。本研究中发现AEL 灌胃4 周后,大鼠体重增加,造模后肿胀度明显升高,踝关节持续肿胀,故灌胃4 周后增加了48 h 的测定时间点,见表2。由表2 可知,与正常对照组比较,造模后6 ～48 h,模型对照组大鼠踝关节持续肿胀(P＜0.01)。秋水仙碱在6、24、48 h 的踝关节肿胀均显著低于模型组(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05)；AEL 高、低剂量均能显著减轻大鼠造模后6 h、24 h 踝关节肿胀(P＜0.01、P＜0.05),造模后48 h 的关节肿胀度有减小趋势,但无统计学差异。

表2 黑果枸杞花青素提取物灌胃4 周对MSU 诱导的AGA 大鼠踝关节肿胀度的影响

ΔΔ 表示与正常对照组比较有极显著差异(P＜0.01)；* 表示与模型对照组比较有显著差异(P＜0.05),**表示与模型对照组比较有极显著差异(P＜0.01)。

研究表明,AEL 能够显著减轻MSU 诱导的大鼠踝关节肿胀,并与摄入时间和剂量成正比。

2.2 黑果枸杞花青素提取物对大鼠步态的影响

AEL 灌胃2 周对大鼠步态的影响见图1。与正常对照组比较,模型对照组大鼠右后肢弯曲,活动减少,受试下肢离开地面,呈三足着地行走步态。与模型对照组比较,AEL 灌胃2 周后,AEL 高剂量能缓解造模6 h 后大鼠跛行步态(P＜0.05),AEL 低剂量对改善大鼠跛行步态效果不显著,秋水仙碱能显著改善造模6、24 h 后大鼠跛行步态(P＜0.01)。

图1 黑果枸杞花青素提取物灌胃2 周对MSU 诱导的AGA 大鼠跛行步态的影响

ΔΔ 表示与正常对照组比较有极显著差异(P＜0.01)；* 表示与模型对照组比较有显著差异(P＜0.05),**表示与模型对照组比较有极显著差异(P＜0.01)。

AEL 灌胃4 周对大鼠步态的影响见图2。与模型对照组比较,AEL 灌胃4 周后,AEL 高、低剂量均能显著改善造模6 h 后大鼠跛行步态(P＜0.05),AEL 高剂量能持续改善模24 h 后大鼠跛行步态(P＜0.05)。

图2 黑果枸杞花青素提取物灌胃4 周对MSU 诱导的AGA 大鼠跛行步态的影响

ΔΔ 表示与正常对照组比较有极显著差异(P＜0.01)；* 表示与模型对照组比较有显著差异(P＜0.05),**表示与模型对照组比较有极显著差异(P＜0.01)。

2.3 黑果枸杞花青素提取物对大鼠血清尿酸的影响

AEL 灌胃5 周对大鼠血清尿酸水平的影响见表3。与正常对照组比较,模型对照组大鼠喂食质量分数2.5%氧嗪酸钾饲料后2 h、3 h 血清尿酸显著升高(P＜0.01),模型制备成功；与模型对照组比较,AEL 高、低剂量均能明显抑制血清尿酸升高(P＜0.05),且3 h 后AEL 高、低剂量组大鼠血清尿酸水平显著低于模型对照组,AEL 高、低剂量组抑制血清尿酸升高的作用相当。结果表明,AEL 对氧嗪酸钾诱导的大鼠血清尿酸水平升高有明显抑制作用。

表3 黑枸杞花青素提取物灌胃5 周对大鼠血清尿酸的影响

ΔΔ 表示与正常对照组比较有极显著差异(P＜0.01)；* 表示与模型对照组比较有显著差异(P＜0.05)。

3 结论

尿酸排泄减少或尿酸生成过多使得机体尿酸持续在较高水平,导致关节腔尿酸盐晶体析出而诱发炎症,被认为是急性痛风性关节炎发作的关键病理过程^[22]。本研究发现AEL 能改善AGA 大鼠踝关节肿胀度和跛行步态,同时具有降尿酸的作用,并呈时间剂量依赖性,提示AEL 能从抗炎和降尿酸两个方面缓解大鼠急性痛风性关节炎发作时的症状。急性痛风性关节炎的发病机制非常复杂,后续将对黑果枸杞花青素提取物在防治急性痛风性关节炎的作用机制进行深入研究,为黑果枸杞花青素防治痛风的功能性食品的开发提供科学依据。